作者：Stuart B Goodman，美国斯坦福大学骨科
译者：段瑞蒙 审校：陈献韬
摘要：四肢主要负重骨的骨骺端和干骺端骨坏死是一种与受累腔室骨细胞和骨髓局部死亡有关的疾病。慢性炎症是骨坏死的一个主要特征，如果持续的炎症没有得到解决，将导致进行性塌陷和随后的退行性关节炎。在塌陷前阶段，年轻骨坏死患者的主要治疗目标是尝试保留关节而不是关节置换。在这方面，有或无骨髓提取浓缩物（BMAC）局部注射的髓芯减压术是一种公认的循证方法，有助于阻止病情进展并改善早期骨坏死的结局。然而，有些病人对这种治疗反应不佳。因此，谨慎的做法是在解决成骨和血管生成缺陷的同时考虑缓解慢性炎症。有趣的是，炎症、骨坏死和骨愈合过程高度相关。因此，调节先天免疫系统、间充质干细胞-成骨细胞谱系等细胞间的生物学过程和相互作用对于炎症的消散和随后的修复提供局部微环境非常重要。这篇综述总结了与骨坏死相关的临床和生物学原理，并提供通过局部干预来调节慢性炎症和促进骨形成和血管生成的潜在策略。虽然这些研究仍处于临床前阶段，但我们希望能够开发出安全、有效和高性价比的干预措施来挽救患者的自身关节。关键词：慢性炎症，骨坏死，骨生成，血管生成，骨愈合，炎症炎症：一般原则
急性炎症是所有组织和器官在物理（机械）、化学、感染、热和其他类型的伤害性刺激下愈合的第一步。这种创伤导致先天免疫系统的激活，随后释放细胞因子、趋化因子、活性氧和其他促炎因子，并触发补体和凝血系统。这些事件是由损伤部位的细胞或细胞内的病原体相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs）的特定化学基序引发的的模式识别受体（PRR）识别。PAMP是感染有机体的衍生物，DAMP是已经死亡或即将死亡细胞的分子副产物，也被称为内源性危险信号。最重要的PRR包括Toll样受体（TLR）、C型凝集素受体、NOD样受体、RIG-I样受体等。先天免疫系统的急性炎症反应是一种广泛性反应，目的是根除或去除有害性刺激，启动细胞碎片的清除，并开始分解和重建正常宿主组织。有趣的是，修复和更新阶段是由促炎环境辅助的，在肌肉骨骼和许多其他组织，激活间充质干细胞(MSCs)和内皮祖细胞在趋化因子梯度的方向下迁移到损伤区域。急性炎症可导致原生宿主组织的恢复、纤维化或慢性炎症。慢性炎症是一种持续的损伤状态，其中间或有急性炎症和持续纤维化，尽管这些尝试最终并不能成功修复。简单地说，先天免疫过程(如果适用的话，可理解为更有限的抗原特异性适应性免疫系统)不能克服有害的不利刺激来重建正常的解剖和生理。因此，尽管机体不断动员所有生物资源，但体内平衡却从未实现。慢性炎症也是一种能量需求增加的状态，其中细胞器（如线粒体、内质网和细胞的其他重要组成部分）耗尽、无效、功能失调和功能下调。如果慢性炎症持续存在，生物体的复原力和生存能力将面临风险。先天免疫系统的细胞分布包括单核细胞或巨噬细胞谱系的细胞，特别是局部DAMP和PAMP敏感巨噬细胞、多形核白细胞（中性粒细胞）、树突状细胞、肥大细胞、特定淋巴细胞亚群（包括NK细胞）和其他细胞类型。慢性炎症涉及上述细胞以及其他T和B细胞亚群。成纤维细胞和血管谱系细胞出现在急性和慢性炎症状态。在炎症消退过程中，促炎M1巨噬细胞极化为抗炎、促重建、促血管生成的M2表型，局部间充质细胞和血管祖细胞相互发生作用。骨坏死包括一系列导致骨细胞和骨髓死亡的疾病。骨坏死可以是局部的或广泛的（多灶性）。许多不同的诱发因素都与骨坏死有关。一般来说，ONFH是由创伤性事件（如股骨颈移位骨折、髋关节脱位或髋关节脱位闭合复位）引起的，也可能是非创伤性的，即不是由机械损伤引起的。创伤病因被认为会直接损害局部区域的血液供应。非创伤性病因包括使用高剂量皮质类固醇、过量酒精摄入、自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮(SLE)、放疗、化疗、高凝状态、镰状细胞病、戈谢氏病和其他原因。骨坏死通常发生在骨骺和干骺端，并可导致骨塌陷和继发性退行性关节炎。必须将骨坏死与过度使用引起的不完全骨折、异常的骨病理性骨折和其他情况进行区分。骨坏死通常发生在髋关节（股骨头）、膝关节（股骨和胫骨髁）和肱骨（头部）的负重大关节，但几乎可以发生在任何骨骼和位置。大多数病例与使用皮质类固醇或酗酒有关，通常发生在处于黄金工作年限的年轻患者中。受累关节的塌陷导致疼痛和终末期关节炎。因此，早期诊断骨坏死很重要，这样可以评估和缓解潜在的刺激因素，限制其进展到晚期。此外，早期诊断和治疗可能会阻止或逆转疾病的进展，从而保留患者自身的解剖结构，避免关节置换手术。不幸的是，我们三级护理中心最近的一项骨坏死研究显示，77%的病例是在ONFH晚期确诊的，影响了保髋进程。
慢性炎症与骨坏死的关系
尽管许多病因与骨坏死有关，但最终涉及到受影响区域的氧气和营养供应不足（图1）。这些事件与骨髓间充质干细胞沿着成脂途径分化增强以及成骨、成血管不足。然而，在某种程度上，受影响的解剖区域显示出慢性炎症、细胞死亡修复受损的组织学证据。实时图像探针分析显示，小鼠血管烧灼诱导骨坏死6周后，活化的巨噬细胞和中性粒细胞局部持续存在。在其他研究中，激素相关的大鼠骨坏死导致PRR toll样受体4 (TLR4)的上调，大多数TLRs的下游适配蛋白髓系分化因子88 (MyD88)和炎症蛋白的主要转录因子核因子-κB (NF-κB)和单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)上调。
图1 骨坏死的病理生理学特征。许多病因都与骨坏死有关。然而，最终的共同病理生理途径涉及到受影响区域的氧气和营养供应不足。这些事件导致骨髓间充质干细胞沿着成脂途径分化增强以及成骨、成血管不足。骨坏死也表现出慢性炎症的迹象：活化的中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞和其他细胞类型的持续积累；TLR4、MyD88和NF-kB的持续激活；促炎介质生成增加。值得注意的是，许多与急性和慢性炎症、骨坏死和骨愈合相关的分子是重叠的，并在先天免疫系统的激活和组织修复中发挥重要作用。NF-κB是伤害刺激诱导的主要促炎转录因子，促炎因子激活或授权MSCs。TLR4是细胞表面的PRR，可被PAMP、DAMPs和其他物质激活。TLR4有两条信号通路：MyD88依赖通路（TLR4/MyD88/NF-κB）和MyD88非依赖性通路（TLR4/TRIF/IRF3）。MyD88依赖性途径激活NF-κB并促进趋化因子MCP-1的表达。MCP-1是单核细胞-巨噬细胞谱系和MSC成骨细胞谱系细胞的趋化剂。MCP-1诱导单核细胞/巨噬细胞的增殖，并促进破骨细胞的分化和活化。在猪模型中，坏死骨的副产物被证明上调了大量的促炎细胞因子，这一机制依赖于巨噬细胞激活TLR4。这一观察已在激素相关ONFH大鼠模型中得到证实，该模型显示TLR4/NF-κB的过度激活和典型Wnt/β-catenin通路的抑制（后者调节细胞周期、细胞迁移和器官生成）。在一项研究中，收集了20名不同阶段ONFH患者的血清，并与正常对照组的血清进行了比较，其中包括TLR4在内的8个基因被确定为潜在疾病严重程度的血清生物标志物。其他生物标志物包括BIRC3、CBL、CCR5、LYN、PAK1、PTEN和RAF1与炎症、骨和软骨代谢以及血管生成有关。这表明，减轻骨坏死并发症的潜在生物学策略可能需要减少慢性炎症，促进骨形成和血管生成。
缓解慢性炎症、促进ONFH成骨成血管的策略
由于创伤(延迟愈合、不愈合)、既往感染、假体周围骨溶解和其他原因引起的慢性临界大小骨缺损的愈合在许多方面与骨坏死中遇到的缺损相似。在一定程度上，这些病因都与慢性炎症有关，包括局部骨坏死、纤维化、成骨和血管生成不足以及组织脂肪浸润。因此，临界大小骨缺损愈合模型的研究与治疗骨坏死病变有关。我们实验室和其他实验室将解决这些困难的临床场景的策略和方法进行回顾。
抑制慢性炎症
鉴于骨坏死与慢性炎症相关，考虑干预这些过程似乎是谨慎的。潜在的治疗方法必须以时间和空间敏感的方式进行，因为急性损伤后软、硬组织的愈合依赖于短时间内(通常是几天)的急性炎症，随后通过授权间充质干细胞和其他细胞启动修复。
鉴于这些事实，以下是缓解慢性炎症的可能方法(图2):
(a)干扰或阻碍受体连接和持续激活，延长炎症过程；
(b)抑制细胞内相关的促炎通路；
(c)阻碍炎症介质的转录、翻译或释放；
(d)干扰末端器官对特定炎症介质的反应；
(e) 通过提供信号和线索来促进相互竞争的生物过程，从而改变局部细胞微环境；
(f)完全消除与慢性炎症相关的细胞。
图2 解决慢性炎症的潜在治疗方法。急性炎症是损伤后组织愈合所必需的。然而，慢性炎症是有害的，并导致组织完整性和功能的丧失。本文列出了缓解慢性炎症的潜在途径。其中许多策略已用于治疗全身性慢性炎症疾病，如类风湿性关节炎（RA）。RA的药理学药物包括抗代谢药物和其他化疗药物、直接或间接干扰特定细胞因子、趋化因子和其他促炎分子如肿瘤坏死因子α（TNFα）、白介素（IL）如IL-1β和IL-6等的疾病修饰药物和生物制剂。尽管这些药物对治疗风湿性关节炎非常有效，但对于由于骨坏死和严重骨缺损引起的慢性炎症，全身注射这些可能产生潜在严重副作用的药物并不实用。因此，局部用药可能是首选路线。关于缓解骨坏死和临界大小骨缺损相关的慢性炎症，以下局部方法具有前景：抑制特定的TLRs，尤其是TLR4；干扰以下蛋白：衔接蛋白MyD88、转录因子NF-кB或趋化因子MCP-1和巨噬细胞抑制因子（MIF）；通过局部递送IL-4或IL-13将巨噬细胞极化状态从M1促炎性改变为M2抗炎表型。我们的实验室和其他实验室已经在模拟与磨损颗粒病相关的慢性炎症的模型中使用了这些策略。输注IL-4（一种抗炎细胞因子）是在多种临床条件下抑制慢性炎症的一种重要假设策略。IL-4蛋白可以直接，通过支架或其他设备，也可以通过转基因间充质干细胞过表达IL-4传递，也可以通过NF-кB上调。这种方法是我们实验室治疗慢性骨缺损和骨坏死的一大方向。其他潜在的免疫治疗方法包括递送IL-13、IL-10、IL-1Ra、TNFsR等。
生物分子和/或细胞的局部输送促成骨和成血管(图3)
图3 在骨坏死中，局部传递生物分子、细胞治疗和基因治疗以增强骨生成和血管生成的潜在方法。缩写：BMAC，骨髓抽吸液浓缩物；MSCs，骨髓间充质干细胞；GAMs，基因激活基质。
生物分子和药物
局部注射生长因子和其他分子以增强成骨和成血管，或抑制破骨细胞以治疗骨缺损和骨坏死并不是一个新概念。这些因子包括转化生长因子（TGF）超家族成员，包括TGFβ和骨形态发生蛋白（BMPs）、成纤维细胞生长因子（FGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF），胰岛素样生长因子（IGF）、肝细胞生长因子、甲状旁腺激素（PTH）等。这些试剂以蛋白质的形式被输送到各种聚合物、支架、胶结物等中。这些生物分子作为药物传递系统被吸收、包埋、固定化或包覆，然后通过扩散、基质或交联剂降解来释放。其他用于局部投放的药物包括皮质类固醇和其他甾醇、他汀类和双膦酸盐。这些生物分子通常是多功能的，调节多种途径，包括炎症级联反应、成骨和血管生成，并具有其他生物靶点。虽然其中一些干预措施已在广泛的临床前和有限的临床研究中被用于治疗骨缺损，但很少用于临床治疗骨坏死。事实上，临床试验并没有广泛的接受和实施。在最近的系统综述中，双磷酸盐或他汀类药物的全身治疗尚未被证明对ONFH有效，但局部治疗可能有效。骨坏死病变中坏死的、无血管的恶劣生物环境的挑战可能对药物治疗的要求太高而无法成功。
细胞治疗
ONFH和其他骨坏死的细胞治疗不再是实验性。在骨坏死的早期阶段，使用浓缩的自体髂骨骨髓抽吸液浓缩物联合髓芯减压（CD）是有证据的。Hernigou等人2018年报道，对125名患者进行同期双侧CD。在接受CD治疗的两个髋关节中的一个，他们添加了骨髓抽吸浓缩物（BMAC）。注射到CD部位的MSCs（或集落形成单位成纤维细胞[CFU Fs]）的数量范围为45000至180000个细胞，平均为90000±25000个细胞。经过20~30年的随访，发现添加BMAC可将股骨头塌陷率从72%降至28%；接受髋关节置换术的患者比例从76%降至24%。使用定量MRI分析，接受BMAC的组中骨坏死病变所占的股骨头体积从44.8%降至12%。这些都是令人信服的数据。将BMAC加入CD治疗ONFH的概念将受益于一项大型前瞻性随机多中心研究。对BMAC进行了广泛的临床前和实验室分析，并在最近的出版物中进行了综述。许多因素与收获细胞的数量和活力有关，包括患者的年龄和性别、是否存在医学共病和药物治疗，如皮质类固醇和其他药物，吸烟，肥胖等。值得注意的是，BMAC不是骨髓间充质干细胞，而是不同单核细胞类型的聚合体，包括巨噬细胞、淋巴细胞、肥大细胞和其他细胞。事实上，从髂嵴收获的30000个有核细胞中仅存在约1CFU-F，这相当于每cc骨髓抽吸物约600CFU-F。尽管BMAC在治疗骨坏死方面取得了明显的成功，但仍存在一些问题。BMAC是注射治疗骨坏死的首选细胞吗？需要多少不同血统的细胞？仅MSC就足够了吗？能否改变MSCs以减轻炎症并促进骨坏死病变的愈合？同种异体骨髓间充质干细胞同样有效吗？虽然这些问题目前还没有明确的答案，但有一些相关的观察需要提及。大量证据表明，巨噬细胞的加入将增强骨髓间充质干细胞的成骨能力，可能是通过授权后者细胞和参与持续的骨髓间充质干细胞-巨噬细胞的串扰来增强组织修复。这些发现证实了注射骨髓间充质干细胞和造血谱系细胞凝聚。除此之外，单独分离、扩增和递送自体和同种异体MSC（或其副产物，如外泌体）以修复骨缺损和治疗骨坏死。本文作者最近发表的一篇文章总结了骨髓间充质干细胞表型改变以促进骨愈合。其中一些技术包括生物制剂预处理、MSC暴露于低氧环境以及细胞的基因治疗或基因操纵。还有一些方法包括优化MSC的分离、扩展和存储技术，改进所使用的载体或支架的物理、化学和其他特性，以及细胞植入的宿主中的缺陷。基因治疗
细胞基因治疗和基因操纵修复肌肉骨骼组织是一个令人兴奋的概念，已经在其他地方进行了综述。基因治疗可以使用化学和物理方法来完成，而不需要病毒将DNA或微粒运输到细胞中。通过使用基因激活矩阵(GAMs)或其他平台，根据预定的时间和空间参数向周围细胞释放遗传物质。通过使用病毒载体在体外改造自体或异体基因细胞，然后在体内注射这些细胞，或者直接将基因转移到体内细胞。基因疗法也被用于治疗骨坏死，主要是在临床前研究。我们使用BMAC、骨髓间充质干细胞、预处理骨髓间充质干细胞和将过表达IL-4的基因修饰的骨髓间充质干细胞注射到髓芯减压骨道中，同时使用或不使用新型3D打印定制的功能分级支架作为兔ONFH的治疗。在临床前研究中，在骨坏死的急性期加入过表达IL-4的MSCs可能通过抑制急性炎症反应而阻碍骨再生作用。利用生物分子、药物、细胞和基因疗法来治疗骨坏死是非常令人兴奋的。然而，除BMAC治疗外，这些治疗通常处于临床前阶段，必须权衡多种潜在风险，包括对邻近细胞的不良影响，以及免疫原性、致突变性和致癌性。此外，还必须处理给药的时间、剂量和最佳平台以及与成本效益有关的问题。慢性炎症通常会导致正常宿主组织被不良的纤维血管间质瘢痕取代，其中充满了急性和慢性炎症细胞。这种替代组织不具有宿主组织的解剖、生理、代谢和功能的完整性。在临床病例中，器官的大部分受到慢性炎症的影响，生命过程的可能受到损害，如慢性肝炎、肾炎、糖尿病、心肺疾病、风湿性关节炎、衰老和其他疾病。相关的发病率和死亡率很高。在这方面，骨骼和关节也没有什么不同。慢性炎症常见于炎症性关节炎、慢性骨髓炎、骨折不愈合和骨坏死。这表现为先天性免疫系统的持续过度活跃，在某些情况下，还表现为适应性免疫系统的过度活跃。在骨坏死中，尽管有各种相关的易感因素，DAMPs反应的慢性炎症阻碍了新生血管和成骨。如果不加以制止，这种情况将发展为关节塌陷和终末期关节炎。多发性骨坏死的情况更为严重。早期骨坏死的最佳治疗包括缓解慢性炎症的策略，以及在关节塌陷前促进成骨和血管生成。在这些情况下，由于患者年龄小，保留关节是一个比关节置换更好的选择。然而，对于这些复杂病例的确切治疗，通常存在持续的易感因素（例如持续高剂量皮质类固醇治疗SLE），有时会限制医生的选择。全身药理学方法在治疗和预防成人骨坏死方面似乎没有什么用处。早期诊断很重要，以便可以审查和实施治疗方案。这表明需要鉴别和筛查高危患者，至少要有全面的病史，并可能有选择性的非侵入性成像，例如MRI。在塌陷前阶段，用髓芯减压局部治疗，可能添加生物辅助剂，如BMAC，似乎是合理的。研究应解决BMAC的成分和剂量，以优化骨坏死缺损的重建。具体的生物学方法可能集中于伴随的慢性炎症及其对成骨和血管生成的不良影响。从患者自身组织中提取的细胞和生物制剂的定制设计，虽然目前还没有得到FDA的批准，因为它们涉及的操作超过最小限度，但可能会进一步改善骨坏死再生医学的目标。定制设计的机械植入物可能会延迟骨骼和软骨的物理塌陷，并为组织再生提供重要的信号提示。这种3D打印且可生物降解的植入物目前正在我们实验室的临床前研究中进行测试。希望这些技术中的一些将被证明是安全、有效和经济的。这样，全球数百万骨坏死患者的疼痛、残疾和发病率可能会得到缓解。本文仅代表作者个人观点，不代表骨今中外官方立场。希望大家理性判断，有针对性地应用。
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