人心肌TnI的生物学特性测定及其在临床诊断中应用
肌钙蛋白I（troponin I,TnI）和TnC、TnT组成复合物，在肌肉收缩和舒张过程中起重要调节作用。大量临床研究证实，心肌TnI(cTnI)为心肌损伤最特异、最敏感的血清标志物之一，被广泛应用于临床诊断。本文就cTnI的生物学特性和临床应用进展作一概述。
1 人cTnI的生物学特性
1．1 cTnI的基因结构与定位 cTnI由基因TNN13编码，TNN13基因全长6.2kb，由8个外显子构成，位于19q13.4。1990年，Vallins等克隆人心肌cTnI的全长cDNA。TNNI3为TnI基因家族和一种同种型（isoform），为肌型，另外两种为骨骼肌型，它们分别编码慢反应sscTnI（由TNNI编码）和快反应fscTnI(由TNNI2编码)。TNNI1和TNNI2基因在骨骼肌细胞中的特异表达，需要上游的启动子元件和位于内含子区的增强子等，而在心肌肌细胞内，包括98bp启动子序列就能驱动TNNI3基因的表达，此基因前三个内含子中未发现有增强子的活性。Barton等人发现，编码TnI和TnT亚型（cTnI，fTnI，sTnI）的六个基因位于三条染色体上，每一条染色体上都有一对TnI-TnI基因。TNNI和cTnI的基因位于1号染色体上，两基因之间的插入序列长度大于20kb；TNNI2和fTnI基因位于11p15.5，二者紧密连锁，两基因之间插入了长度约为100~300kb的序列；TNNI3和sTnI基因在19号染色体上，两基因之间有一段2.6kb的插入序列。在这三对基因中，TnI基因都位于TnT基因的上游。TNNI3基因异常可以导致肥厚性心肌病（hypertrophic cardiomyopathy，HCM）。HCM是幼年瘁死常见的病因，是一种常见染色体显性遗传病，临床症状为心室增生并伴有肌纤维的紊乱。目前发现，至HCM的cTnI基因突变有六种，它们分别是五种错义突变：R145G，R145Q，R162W，G203S，K206Q和一种缺失突变del183K。
1．2 cTnI蛋白质的结构及其抗原性 cTnI为一具有209个氨基酸的多肽，相对分子量为24 000，预测的pI约为10。CTNI与ssTnI和fsTnI有40%的同源体，主要区别在1、2、3位外显子。CTnI的1、2、3位外显子较长，可编码N端的47个氨基酸，而sTnI1、2、3外显子短，只能编码N端21个氨基酸，较cTnI短26个氨基酸，5、6、7外显子在cTnI和sTnI具有高度的同源性。CTnIN未端26个氨基酸中的两个丝氨酸可以通过cAMP依赖的蛋白激酶的磷酸化作用，调节cTnI的功能。CTnI蛋白质以两种形式存在于心肌细胞内，即小部分游离于胞质中，为可溶性，大部分以结构蛋白形式固定于肌原纤维上，为不溶性。当胞膜完整性因缺血或缺氧等受到破坏时，游离的cTnI可迅速透过细胞膜进入血流；而结合的cTnI则逐渐分解出来，成为游离的cTnI。所以，急性心肌梗死时，cTnI可较早地在血中出现，并持续较长的时间。在cTnI蛋白质的功能域中，抑制区是其最重要的功能区。它能在无钙离子存在的情况下，与组成细纤丝的肌动蛋白相互作用，抑制肌球蛋白的ATPase活性。抑制区的序列最短可仅包含残基137~148。CTnI的C端残基187~198也影响肌动蛋白的结合和其抑制作用的发挥。
Ferrieres等人利用68条重叠的能覆盖cTnI全长序列的合成肽进行抗原表位作图来研究cTnI抗原性的特点，结果发现，实验中所用的所有16株鼠抗人cTnI单抗至少能识别其中一个肽的表位，这表明这16株抗cTnI的单克隆抗体对cTnI的识别不依赖于蛋白质的三级结构。据这些肽与兔或鼠抗人cTnI多克隆抗体的反应活性可知，cTnI蛋白质大部分序列均具有抗原性，其中N末端和C末端的抗原性最强。利用计算机程序对cTnI蛋白质二级结构进行预测的结果显示，cTnI是一种富含a螺旋的蛋白质。结合抗原表位实验结果，可以推测cTnI不是球蛋白，其蛋白质肽链可能采取一种更为伸展的构想，这种结构的蛋白质分子，其大部分序列都具有抗原性。
1．3 cTnI表达的心肌特异性 人cTnI基因是在心肌特异表达的。Bodor等运用cTnI特异的单抗，对不同来源的人肌肉组织冰冻切片进行组化染色，同时用免疫荧光法测定组织匀浆中的cTnI水平。实验结果表明，正常胎儿和成人的骨骼肌组织，及所有的多肌炎和肥大性进行性肌营养不良（DMD）患者的组织中都没有cTnI心肌表达。Ricchiuti等的研究进一步证实了cTnI心肌的表达的特异性。他们从4例健康人心肌、5例健康人骨骼肌、7例终末期肾病患者骨骼肌和5例DMD病人骨骼肌的标本中提取RNA，分别针对cTnT 、sTnT、 cTnI序列的特异引物，进行逆转录PCR扩增。同时，分别用cTnT 、sTnT、 cTnI的单抗，对蛋白样品进行westerm blot分析。结果发现，在所有的心肌标本中、4例终末期肾病患者骨骼肌中、2例DMD患者骨骼肌中检测到cTnT的PCR扩增产物，蛋白质印迹试验也是阳性。在健康人骨骼肌中均没有发现cTnT mRNA的表达；在所有的心肌标本中，均检测到cTnI特异的mRNA扩增产物；在健康人或病人骨骼肌标本中没能检测出cTnT mRNA的表达。
2 血清cTnI 测定的方法学
cTnI 的测定始于20世纪80年代中期，多采用双抗体竞争放免法和竞争性ELISA测定法。由于实验中所用的抗体都为多克隆抗体，因而交叉反应多，灵敏度差，测定低限只能达到4μg/L。单克隆双抗体夹心放免法和双抗体夹心ELISA法使测定的灵敏度大大提高，测定低限为0.1~0.2μg/L。目前，cTnI的检测多采用化学发光法。其中Hossein-Nia所报道的化学发光免疫测定法，将2株单抗共价偶联于顺磁珠（paramagnetic particles）上作为固相，利用亲和纯化的对cTnI的N末端区特异的多抗，用化学发光物质标记后作为检测抗体，大大提高了测定的精确性和敏感性，此法测定的低限为0.15μg/L。
据报道，对同一病人的血标本，用目前市售的几种不同的化学发光免疫测定试剂盒测定血清中的cTnI水平，各测定结果之间可差10~20倍。这引起了众极大的关注。分析原因，可能由以下几个方面引起：①不同测定方法运用不同校正品；②取样要求的不同，如血清、血浆或全血及使用不同的抗凝剂；③不同抗体识别不同抗菌素原表位的能力不同，或cTnI与TnC 或/和TnT形成复合物时构象的不同；④包含不同表位的cTnI蛋白酶角片段，由于不同的清除率或降解程度的不同，在血清中的半衰期不同；⑤不同的检测系统本身的假阳性；⑥一些突变位点的存在可能影响cTnI某个抗原表位；⑦血循环中cTnI被氧化、还原、磷酸化等。目前较为一致的观点普遍认为，造成各方法测定结果差异的原因是由于使用不同的校正品所致。Shi Qinwei等运用StratusⅡ(Dade International),Opus(Behring Diagnostics)和ACCESS（Beckman Instrument）系统分别测定Stratus品、ACCESS质控品和Opus质控品。结果表明，除了Stratus质控品用ACCESS和Opus系统测不出值以外，另外两个质控品用不同系统所测值之间的最大变异不超过5倍。这也表明，不同校正品的使用最多造成了不同系统之间的20%的变异。因此，可能存在有其他影响cTnI的方法都为夹心免疫测定法，因而需要抗体识别的靶表位完全暴露并有正确的构象，且两靶表位之间的区域不被水解。而运用不同抗体进行测定的不同方法，就需要不被水解的cTnI的区域不同。所以cTnI各区域不同的降解情况，也就可能导致了各测定方法之间的变异。Shi Qinwer 等用分别表达有4个cTnI片段的E.coli裂解液，来测试它们与StratusⅡ，Opus和ACCESS免疫试剂盒之间的反应性。并用不表达任何重组蛋白的E.coli细菌裂解液作为阴性对照，用纯化的全长cTnI作为阳性对照。结果表明，Stratus和Opus抗体识别cTnI的N末端部分，而ACCESS的抗体识别cTnI的C末端部分。应用对cTnI的N末端部分和C末端部分特异的单抗，对加有重组cTnI的正常人血清和加有重组cTnI复合物的正常人血清，在37℃分别孵育2、4、6、24和48h后，行westerm blot分析的结果表明，cTnI的C末端部分更易被降解。这也可能是造成这三种测定方法之间变异的主要原因之一。
鉴于各种可能影响cTnI测定因素的存在，就给判断cTnI参考范围和变异系数，分析测定的干扰因素，决定诊断的窗口期及诊断和预后的界值等带来困难。解决cTnI测定的标准化问题，已是众望所归。Katrukha等用不同的免疫学方法分析在人坏死组织的血清中cTnI被蛋白酶降解的情况时，发现位于氨基酸残基30~110之间的片断高度稳定，不被降解，这可能是由于其与cTnC形成复合物之故。因为游离cTnI在血循环中的半衰期只有5 min，他们认为，血清中的cTnI主要以复合物的形式存在。Giuliani等利用ELISA夹心法，分别测定了血清中cTnI、cTnI-cTnC和cTnI-cTnC-cTnT的复合物。结果发现，血清中cTnI的主要形成二聚体复合物cTnI-cTnC。根据cTnI的C末端易被降解，及其易形成复合物的特点，有理由认为，血清中的cTnI，是以其C末端被降解的形式，稳定存在于肌钙蛋白复合物中。这也就为解决cTnI测定的标准化问题提供了思路。Shi Qinwei等认为，若某一标准品为cTnI所有抗原表位等摩尔浓度的混合物，并且测定中所有抗体，能够识别血清中最稳定cTnI片段上的抗原表位的话，会有助于cTnI测定的标准化。鉴于cTnI复合物在有螯合剂存在的情况下易解离的特性，最新研究表明，通过基因工程方法得到的两种cTnI-cTnC单链多肽：ScTnI-C和ScTnI-C-2(ScTnI-C由全长的人cTnI和cTnC组成，ScTnI-C-2由人cTnI28~110片段和全长cTnC组成)，经单抗亲和层析纯化后，均可作为标准品使用。
3 cTnI 测定的临床意义
3．1 诊断急性心肌梗死（AMI）WHO推荐患者有胸痛、心电图改变、心肌酶学异常三项指标中两项符合，即可诊断为AMI。其典型病例易确诊，而不典型病易被漏诊。25%的AMI患者心电图无异常改变，故对这部分病人血清学检查显得尤为重要。常用AMI的血清指标有：cTnI、肌红蛋白（Mb）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌酸激酶（CK）、心肌肌钙蛋白T（cTnI）等。这几项指示在AMI时的血清学行为如表1所示。
表1 诊断AMI有关指标的血清学行为
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由此可见,cTnI在特展品及ROC效率上具有独特的优势,而在AMI发生初期,其敏感性较差,但其诊断的窗口期最长,可达7-9天.另外,作为诊断AMI“金标准”的CK-MB，由于采用催化活力单位，易受同工酶（CK-BB，CK-MM）等亚单位的干扰，使结果偏高产生假阳性，如采用质量浓度单位，CK-MB的特异性问题仍无法解决。因而，对似AMI患者，早期血清指标要做：Mb、CK-MB两项，MB仅为过筛试验，CK-MB（-）、cTnI（+）者你认为是高危患难者，CK-MB（-）、cTnI（-），临床症状可疑者，需做3，6，9，12h cTnI动态观察。以减少AMI的漏诊，因为cTnI在胸痛10h对AMI诊断的特异性、敏感性、ROC效率均为1.00。
3．2 监测AMI病人的溶栓后再灌注情况，胸痛缓解，ST段改变恢复正常以及再灌心律失常是冠脉再通的指标，然而这三项指标仅表现于15%的患者。基于外周血CK、CK-MB酶活性变化曲线，对于再灌注的效果只可作精略的回顾性评价。成功监测接受深栓治疗患者的再灌注，可以使一部分溶栓失败的病人受益于进一步的介入治疗。Apple等对25例AMI患者溶栓前后cTnI、CK-MB及Mb的变化进行了观察，并与冠状动脉造影结果相对应，发现冠状动脉再通者cTnI、CK-MB及Mb值于溶栓90min后均显升高，而冠脉依旧栓塞者以指标升高不明显。并且发现如果以溶栓后90min与溶栓前cTnI差值为指标，可于溶栓90min内较好地反映再通情况，敏感性优于CK-MB及Mb。
3．3 对伴有创伤横纹肌溶解、心肌损伤患者的诊断。
Alain等检测了15例入院24h的早期创伤后横纹肌溶解、心肌损伤患者的血清的cTnI和cTnT。有4例患者入院时未测出cTnI，其cTnT值较低，其余患者入院时即测出cTnI。24h后对这15例病人再次进行检测，发现13例横纹肌溶解、心肌损伤患者（24份标本）cTnI和cTnT间密切相关（r=0.83）。其中8例患者cTnI和cTnT均低于其相应的参考值的上限。2例患者cTnI和cTnT低于参考值的上限，但cTnT高于参考值的上限，这2例患者肌酐均大于250umol/L，提示cTnT的升高可能是未预料的肾功能衰竭所致。该研究证实cTnI和第二代cTnT（试剂）在横纹肌创伤后早期患者有相似的变化。
3．4 对病毒性心肌炎（VMC）的诊断 心肌酶学检查作为心肌损伤的指标，在病毒性心肌炎的诊断中占重要地位。既往常规应用心肌酶谱检查作为心肌损伤的指标，但其敏感性和特异性较差。刘智勇等人探讨了cTnI对病毒性心肌炎价值，结果发现，cTnI、CK-MB、CK、AST、LDH的阴性率（%）分别为69.4,18.1,22.2,19.4和16.7。cTnI与CK-MB、CA、AST的敏感性比较都具有统计学意义（P<0.001）.且cTnI仅在心肌特异表达,而CK-MB、AST、LDH非心肌细胞所特有，可产生假阳性。因而cTnI作为心肌细胞受损的敏感而特异的指标，在心肌炎早期诊断中具有很好的应用前景。
4 小结
cTnI测量是目前诊断心肌损伤的一项很有前景的标志物。具有特异性好，灵敏度高的优点。但由于它在血清中不稳定，极易被降解，及易形成复合物等特点，使人们对解决cTnI测定的标准化问题一筹莫展。如何制备得到针对cTnI稳定区特异的、亲和力高的单克隆抗体，及可溯源和稳定的标准品，成为人们关注的焦点。许多人已在这方面作了尝试，结果还有待评价。
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